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        去除核酸酶

        DNA酶 DNase ;核酸外切酶 Exonuclease;

        DNase是普遍存在的多功能酶,主要通過磷酸二酯鍵的水解來催化核酸的降解。DNase將單鏈和雙鏈 DNA 酶切成含 5' 磷酸的寡脫氧核糖核苷酸。它的活性依賴于鈣離子,并能被二價錳離子或鎂離子激活。錳離子存在條件下,DNase可在同一位點剪切DNA雙鏈,形成平末端,或1-2個核苷酸突出的粘末端;鎂離子存在條件下,DNase可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點。它可以非特異性地切割DNA,產生5'端為磷酸基團的二核苷酸、三核苷酸、或寡核苷酸。 DNase較為常見的應用是去除RNA制備過程中的DNA污染,在制備RNA過程中降解殘留的DNA來控制基因組DNA的量(低于10μg/ml),以免其影響后續的RT-PCR,但是DNase污染是分子生物學實驗室主要關注的問題,污染會導致時間、金錢和數據的損失。生物試劑當中不含DNase,以及建立和維持一個無DNase的實驗體系對實驗室研究人員來說是非常必要的。由于DNase無處不在,在分子生物學應用中使用的水和緩沖劑可能是污染的常見來源。必須在滅活水和緩沖液中DNase以后,才可以放心安全的使用。DNase去除的方法有苯酚萃取法和加熱法。DNase 通過在 80°C 下孵育 10 分鐘即可熱滅活,檢測不到有活性的DNase。

        核酸外切酶 Exonuclease 是一種 3' 到 5' 核酸外切酶,用于單鏈 DNA 降解,導致從單鏈 DNA 的 3'-羥基末端產生 5'-磷酸單核苷酸。這種 3' 到 5' 外切核酸酶對單鏈 DNA 具有高度特異性,不會與雙鏈 DNA 或 RNA 發生反應。通過80°C 熱處理 15 分鐘即可使核酸外切酶失活。

        核糖核酸酶RNase;

        RNase是分子生物學中常見到的一種酶,在核酸代謝中發揮著重要作用,幾乎任何一種原核生物與真核生物細胞類型中均可找到RNase。核糖核酸酶是一類水解酶,可催化核糖核酸(RNA)分子在體內和體外降解成更小的成分。核酸酶在轉錄和翻譯水平上起作用,并通過切割磷-氧鍵來分解 RNA。RNase分為核糖核酸外切酶和核糖核酸內切酶。RNase 參與調節身體的許多催化功能,它的正常功能是在體內酶促 RNA 降解成更小的寡核苷酸。 RNase 無處不在,它幾乎存在于每個生物體的任何地方。對于大多數研究,它們是從不同的哺乳動物組織中分離出來的,例如大腦、肝臟、胰腺、皮膚細胞、嗜酸性粒細胞和其他幾種體細胞。RNase 已從許多生物體中分離出來并進行生化表征,包括寄生蟲、細菌、真菌、植物和哺乳動物的各種組織。

        生物體液中和分泌液中都自然存在RNase,生物在生命周期都會自主分泌RNase,是生物體的防彈裝置,可防止外源RNA入侵。RNase的作用有很多,它對于生物體的生存也是必不可少的。RNase也存在于皮膚碎屑中,掉落于實驗臺的毛發上,或粘附于衣物的寵物毛發內。不過,大多數環境中RNase的首要來源是微生物——即細菌和真菌。

        RNase具有二硫鍵結構,排列成一種微小緊湊的蛋白構象,因此穩定性極強,極難滅活。在無變性劑存在的條件下,變性的RNase會重新恢復其天然結構及部分功能。RNase耐熱、耐酸堿,在反復凍融,甚至高壓滅菌后仍會保留相當的活性。

        RNase穩定的天然屬性使它能夠有效抵抗很多去污方法,它是所有分子生物學實驗室都非常關注的質控問題。RNase會降解與其接觸的任何RNA分子,干擾實驗甚至導致寶貴的樣品丟失,導致實驗數據的丟失,以及時間或金錢的浪費。因此,RNase污染檢測是生物制品,試劑以及分子生物學實驗室環境等的關鍵質控點。目前對于RNase污染的檢測主要通過如下兩個方法進行:一是以RNase的活力單位kunitzu定義為基礎,檢測吸光度OD300在單位時間內的變化值;二是通過與RNA孵育電泳來檢測RNA條帶是否降解。這兩種方法缺點是檢測流程復雜,靈敏度偏低,樣本檢測通量很低等情況,目前沒見有更好的解決辦法。

        在操作過程中,必須消除、檢測和抑制RNase。這種酶容易對核酸實驗造成污染,所以在實驗中必需竭力地避免各種隱匿來源的RNase混入。RNase污染常常導致實驗失敗,如何有效檢測RNase污染源,是令實驗人員頭疼的事情。由于RNase無處不在使得實驗過程中難以保存RNA樣本的完整性,因此需要從源頭入手,一方面要嚴格控制外源性RNase的污染,另一方面要最大限度地抑制內源性的RNase。比如檢測體液、水與緩沖液以及溶液等措施。分子生物學應用中的水和緩沖液成為RNase污染的常見來源。焦碳酸二乙酯(DEPC)高溫高壓處理是滅活水和緩沖液中RNase最常用的方法。

        RNase在多種反應條件下均穩定且有活性,不需要金屬離子來產生活性,有研究指出可在 100°C 時30 分鐘進行熱滅活。

        Protease 蛋白酶;

        蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱,其催化功能是水解蛋白質的肽鍵。它們也被稱為蛋白水解酶或蛋白酶。按其降解多肽的方式分成內肽酶和端肽酶兩類。蛋白酶涉及人類生物學的許多方面,蛋白酶被稱為生物學版本的瑞士軍刀,能夠將長序列的蛋白質切割成片段。蛋白酶是一種酶,它可以破壞蛋白質的長鏈狀分子,以便消化它們。這個過程稱為蛋白水解,它將蛋白質分子變成更短的片段,稱為肽,最終變成它們的成分,稱為氨基酸。我們需要穩定的氨基酸供應才能正常生長和修復。蛋白質最初是一種堅韌、復雜的折疊結構,它們只能用蛋白酶(如胃蛋白酶和胰蛋白酶)分解或分解,使它們成為可供全身使用的氨基酸。

        蛋白酶通常根據其來源進行分類。有些蛋白酶是在我們體內產生的,有些來自植物,而另一些則來自微生物。不同類型的蛋白酶具有不同的生物學過程和機制。

        蛋白酶不僅限于消化目的和細胞外基質和組織的重塑,也是誘導生理免疫反應的關鍵因素。

        例如:血液凝結,細胞分裂,蛋白質回收,免疫支持等。

        蛋白酶在生物系統中無處不在,種類很多,作用廣泛,它們在細胞和生物體的生化、生理和調節方面發揮著不同的作用。它的負面作用是,在生物實驗體系當中,這種無處不在的酶,對實驗的干涉和影響,對實驗結果的不可預見性擾亂是時刻存在的。對實驗的質控是顯而易見的非線性的影響。因此,在生物工藝液體產品中滅活蛋白酶是重要的質控環節,它將強有力的保障在生物流程中蛋白酶不會對實驗以及工藝流程產生負向的干擾性破壞。

        切口酶  NICKase;核酸內切酶Endonuclease;

        切口酶  NICKase催化切割雙鏈DNA中的單鏈或雙鏈,使DNA發生拓撲異構變化的酶。

        核酸內切酶是一種新型酶。像限制性內切酶一樣,它們可以識別特定的 DNA 序列,并在相對于識別序列的固定位置切斷 DNA。然而,不同于限制性核酸內切酶,限制性核酸內切酶只能切斷一條預定的DNA 鏈。這種酶類是基因編輯技術的重要工具,但是在實驗體系當中,尤其是試劑或者生物制劑中存在這種酶類,將會干擾或者破壞核酸類檢測指標,因此,控制其含量是質控的要素之一。

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