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        去除內毒素

        內毒素   Endotoxin   單位Eu/ml

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        內毒素是一種熱原,是革蘭氏陰性細菌細胞外壁的組成部分,如大腸桿菌,傷寒桿菌,痢疾桿菌等。內毒素是磷脂多糖-蛋白質復合物,其毒性成分主要為類脂質A,一部分含有脂肪酸和雙糖磷酸鹽,核心多糖和 O 抗原。脂多糖的脂質部分是分子內毒素活性的原因,脂多糖對宿主有毒性。菌體死亡或者裂解后釋出內毒素,也會發生在正常細胞生長和分裂過程中。雖然脂質 A 不會直接傷害任何組織,但人類和動物的免疫細胞都把它看作是細菌存在的指示劑 ,刺激機體產生反應,意在抵御不受歡迎的入侵者。這種反應完全是先天性的,即不需要先前接觸內毒素。

        由于內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的,因此環境中大量存在內毒素。當內毒素通過機體消化道等方式時并無危害,少量通過注射等方式進入血液后被肝臟枯否細胞滅活,不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—“熱原反應”。內毒素大量進入、集聚于血液中,超過機體各自衛系統的清除能力,則可導致不同程度的內毒素血癥。如果足夠的內毒素進入我們的血液或脊髓液,我們就會發燒,休克,器官衰竭。在極端情況下,甚至可能導致死亡。

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        任何滅菌生產過程可能會導致內毒素或內毒素釋放到產品中,因此注射劑或生物制劑,藥品醫療器械等都要進行內毒素檢測。內毒素檢測確保產品質量和安全性。

        內毒素檢測常用家兔熱原法鱟試驗法(Limulus Test)。

        家兔熱原檢查法是1925年首次廣泛應用于藥品中細菌內毒素檢查的方法。這種方法是給兔子注射試驗液體,然后監測它們體溫上升和發燒癥狀。家兔熱原檢測費時費錢且無法進行定量。它的應用也僅限于不會對試驗動物造成不良影響的產品。這種測試仍然被認為是方法之一,但是現在很少使用,已經被鱟變形細胞溶解試驗或者 LAL 試驗所取代。中國藥典收錄的內毒素檢查法包括2種方法:凝膠法和光度法,使用鱟試劑來定性或定量檢測內毒素。經典的內毒素檢查法,是依據鱟血液中的一種化合物。當內毒素存在時,這種化合物會引起凝血。

        鱟試劑Tachypiens Amebocyte Lysate(TAL)

        鱟試劑是由海洋節肢動物鱟的血液變形細胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品,含有能被微量細菌內毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原,凝固蛋白原,是從棲生于海洋的節肢動物"鱟"的藍色血液中提取變形細胞溶解物,經低溫冷凍干燥而成的生物試劑,能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素和(1,3)-β-葡聚糖。

        鱟試劑廣泛用于生物工藝制劑、制藥、臨床以及科研等領域,用于細菌內毒素和真菌葡聚糖檢測。使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。

        鱟試驗(Limulus Test)

        科學家認為血液呈淡藍色的鱟在醫學研究中有獨特作用。用鱟血制成試劑,再滴入注射液,若試劑立即凝固或變色,就說明注射液內含有使人發熱、休克甚至死亡的細菌內毒素。

        鱟試驗法是國際上檢測內毒素最好的方法,它簡單﹑快速﹑靈敏﹑準確,因而被歐美藥典及我國藥典定為法定內毒素檢查法,并已被世界各國所采用。能生產鱟試劑的主要有美國、日本、中國等國家。TAL與LAL有相同的功效。

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        目前發展了三種基本方法: 凝膠凝塊法、顯色法和濁度法。凝膠凝塊技術可以作為一種非常簡單的檢測方法的基礎。方法是將試劑加入試管中的樣品,并在37 °c 下培養一小時。如果管子上有明顯的血塊,結果就是陽性。這樣可以通過測試連續稀釋半定量。結果表示為內毒素單位EU(歐盟)。這反映了自然發生的LPS 毒性的變異性。顯色法采用合成底物,當底物被內毒素激活的蛋白酶作用時,會產生顏色變化; 濁度法則依賴于凝結素凝塊的梯度變化,以改變樣本的混濁程度。兩者均可作為定量動力學方法,繪制內毒素起效時間標準曲線。分光光度法測定濁度或顏色時所需的內毒素濃度遠低于形成可見凝膠凝塊所需的內毒素濃度,使顯色法和濁度法比凝膠凝塊法靈敏得多。靈敏度由標準曲線上的最低濃度決定。

        LAL試驗現已成為注射用藥物和醫療器械的內毒素檢查的標準方法,并在美國、歐洲和日本藥典中被列為協調方法(USP 第85章,EP2.6.14補充6.6和 JP 通用試驗4.01)。三種方法中的任何一種都可以使用,但如果發生任何爭議,參考方法是凝膠限度試驗。2012年,美國食品藥品監督管理局還發布了針對制藥和醫療器械行業的內毒素和熱原檢測的詳細指南。這包括取樣計劃、樣品儲存、替代內毒素檢查的驗證以及質量定量檢查(QBD)程序的首選用途。在進行內毒素檢測時,有許多要點需要考慮。一是要確保檢測時使用無熱原的標簽和試劑,避免假陽性。醫療器械通常用標準體積的水或適當的稀釋劑沖洗表面,這也必須是無熱原的。一些因素可能會干擾檢測,無論是通過影響內毒素或LAL試劑。例子包括酸堿值、蛋白質濃度和腸外藥物或沖洗液中存在的干擾化學物質。干擾可能導致內毒素檢測失敗,因此對其進行鑒別是非常重要的。這最好通過使用加入適當的參考標準內毒素或認證標準的陽性對照樣本來完成。

        細菌內毒素這個術語實際上與脂多糖(LPS)是同義詞,后者是革蘭氏陰性細菌細胞壁外層的主要成分。革蘭氏陰性細胞壁比革蘭氏陽性菌細胞壁更復雜,有一個由脂多糖組成的外膜或外膜。這是細胞的滲透屏障,在生物膜的形成和周圍環境中大分子的捕獲過程中也起著重要作用。在革蘭氏陰性細菌敗血癥中,熱原性脂多糖的釋放導致大量炎性細胞因子的釋放,可能導致中毒性休克。革蘭氏陰性細菌不斷合成脂多糖,以取代細胞表面丟失的脂多糖,當細胞死亡時,它們從細胞壁釋放出脂多糖。這意味著游離脂多糖,將始終存在于含有革蘭氏陰性菌的環境中。相比之下,革蘭氏陽性菌不會釋放細胞外的內毒素。因此,控制革蘭氏陰性菌在水、其他原料和生產環境中的生長,以防止熱原的產生是很重要的。然而,革蘭氏陰性細菌的缺失并不意味著熱原的缺失。脂多糖是一種非常穩定的材料,不易被加熱或其他方式破壞。在沒有活菌的情況下,它可以在液體和干燥表面持續很長時間。這意味著專門用于檢測內毒素/脂多糖的檢測方法,對于生物制劑,藥品和醫療器械產品的安全性至關重要。

        在水溶液中,內毒素可以存在于不同的聚集狀態,二價陽離子,如 ca2 + 和 mg2 + ,被發現穩定脂多糖的聚集結構,而洗滌劑有助于分解結構成更小的亞單位。雖然細菌通常用0.2 μm 殺菌級過濾器去除,但脂多糖本身很難去除或滅活,因為它的PH值極其穩定。內毒素反應的熱原閾值為每公斤體重1EU(內毒素單位 ~ 0.1 ng)。這個數量的內毒素可以來自105個細菌細胞。

        去除內毒素是生物工藝液體制劑過程中最困難的工序之一。許多商業上可用的產品無法令人滿意地去除內毒素,或者需要耗費時間的孵化步驟。在許多情況下,完全去除內毒素只能通過大量底物損失來實現。

        內毒素不是蛋白質,因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞,只有在160℃的溫度下加熱2到4個小時,或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。內毒素也可產生特異免疫抗體,但其中和作用微弱。

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        細菌內毒素  

        取供試品原液0.2ml加BET水1.4ml,制成8倍稀釋液,作為供試品溶液。用0.125 EU/ ml的鱟試劑,依法檢查中國藥典2020年版四部通則1143,每1ml中含內毒素量不得過1.0EU。

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